實驗原理(lǐ)
堿裂解法提取質粒DNA，是利用(yòng)共價閉合環狀質粒DNA與線性的(de)染色體DNA片段在拓撲學上的(de)差異來(lái)分(fēn)離它們。在堿性環境中，細菌染色體DNA雙螺旋結構解開變性，而質粒DNA的(de)氫鍵雖斷裂，但兩條互補鏈仍相互盤繞處于結合纏繞狀态。将溶液的(de)pH調至中性并在高(gāo)鹽存在的(de)條件下(xià)，染色體DNA、大(dà)分(fēn)子量的(de)RNA和(hé)蛋白質在SDS（十二烷基硫酸鈉）的(de)作用(yòng)下(xià)形成沉澱，而質粒DNA仍然爲可(kě)溶狀态。通(tōng)過離心，可(kě)除去大(dà)部分(fēn)細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，而質粒DNA留在上清液中，通(tōng)過酚/氯仿抽提純化(huà)得(de)到質粒DNA。
實驗器材
恒溫培養箱、台式恒溫搖床、高(gāo)壓滅菌鍋、超淨工作台、高(gāo)速離心機、移液器、移液器吸頭、三角瓶、1.5ml離心管、離心管架、帶有pUC19質粒的(de)大(dà)腸杆菌等。
實驗試劑
(1)無水(shuǐ)乙醇。
(2)LB培養基(1L)：稱量胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化(huà)鈉5.0g溶于800ml蒸餾水(shuǐ)中，用(yòng)1mol/L氫氧化(huà)鈉溶液（或1mol/L鹽酸溶液）調節pH至7.0，然後加蒸餾水(shuǐ)至1000ml，高(gāo)溫高(gāo)壓滅菌後備用(yòng)。
(3)質粒小提試劑盒（離心柱型），試劑盒的(de)産品組成如下(xià)：
1）平衡液BL。
2）溶液P1：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。
3）溶液P2：0.2mol/L NaOH，1%SDS。
4）溶液P3：稱取29.4g乙酸鉀和(hé)11.5ml冰乙酸混合，加H2O至100ml。
5）去蛋白液PD。
6）漂洗液PW。
7）洗脫緩沖液EB。
8）RNase A。
9）吸附柱CP3。
10）2ml收集管。
實驗操作
(1)接一環新鮮菌體于5ml含有适當抗生素的(de)液體培養基中，37℃搖床(200rpm)過夜培養。
(2)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的(de)平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的(de)廢液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(3)将1.5ml過夜培養菌液放于離心管中，12000rpm離心1min，棄去上清液，收集菌體。
(4)向留有菌體沉澱的(de)離心管中加入250μl溶液P1，使用(yòng)移液器吹打徹底懸浮菌體沉澱，使菌體懸浮均勻。
(5)向離心管中加入250μl溶液P2，溫和(hé)地上下(xià)翻轉6～8次，使菌體充分(fēn)裂解，菌液變得(de)清亮黏稠。
(6)向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和(hé)地上下(xià)翻轉6～8次，充分(fēn)混勻，此時(shí)會出現白色絮狀沉澱。12000rpm離心10min。
(7)用(yòng)移液器吸出步驟(6)收集的(de)上清液，轉移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉澱，12000rpm離心10min，倒掉收集管中的(de)廢液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的(de)廢液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重複操作步驟(8)。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心2min，目的(de)是将吸附柱中殘餘的(de)漂洗液去除。
(11)将吸附柱CP3置于一個(gè)幹淨的(de)離心管中，向吸附膜的(de)中間部位滴加50～100μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min，将質粒溶液收集到離心管中。
注意事項
(1)溶液P1在使用(yòng)前先檢查是否已加入RNase A，每次實驗結束後應置于2～8℃環境中保存。
(2)溫度較低時(shí)，溶液P2會出現白色沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴中加熱(rè)幾分(fēn)鐘(zhōng)，搖勻後使用(yòng)。
(3)注意離心機的(de)平衡問題，所有離心步驟均爲使用(yòng)常規台式離心機在室溫下(xià)進行離心。
實驗意義
質粒是共價、閉合、環狀的(de)小分(fēn)子量DNA，在基因工程中，質粒是目的(de)基因的(de)載體。從大(dà)腸杆菌中提取質粒DNA在分(fēn)子生物(wù)學上是一種最基本的(de)方法。
